分子生物学成像系统：选择合适的凝胶和墨迹平台

分子生物学成像系统提供一个数字化的凝胶或膜片输出，可以被查看、定量、存储和比较。它可以设置扫描含DNA和RNA的凝胶、染色蛋白凝胶、化学发光Western印迹、荧光印迹和比色样本。

系统应该用来配合检测结果，而不是反过来。

分子生物学成像系统是如何工作的？

标准成像系统包括密闭光室、相机、镜头、样品台、可用于所需激发的光源、允许仅通过特定发射频率光的滤光片、用于记录图像的软件以及用于图像分析的软件。

对于核酸凝胶，仪器会在荧光染色上照射紫外线、蓝色或其他合适的光。白光常用于可见的蛋白质凝胶。化学发光的西方印迹产生的光是自身产生的，源自化学反应，因此需要灵敏的相机和暗成像室，但不需要高强度光照射样品。

一些一体化平台具备凝胶记录、比色成像、化学发光和荧光等功能，集成于一个外壳中。例如，bio-Rad提供用于成像核酸和蛋白质凝胶及化学发光印迹的系统，这些系统还可以通过可见光通道、远红光通道和近红外荧光通道扩展。

你可以从你运行的样本开始

首先要从实验台开始——而不是在规格表上！

对于主要聚焦琼脂凝胶的教学实验室，紫外、蓝光和白光成像可能是唯一需要的类型。一个精确的蛋白质研究实验室需要精细的化学发光和多个荧光通道。

Thermo Fisher将其可视化系统分为提供简单可视化和软件分析，以及化学发光Western印迹和多通道荧光成像。提醒一下：凝胶记录系统不一定是多模分子成像仪的一级仪器。

将激发源和滤镜与染色剂匹配

每种荧光染料都有其最佳波长范围，用于照明和光的发射。成像系统必须配备合适的光源来激发染料，并配备发射滤光片，使发射光子能够到达相机，同时拒绝用于激发染料的光。

以下是可以包含以下功能的系统示例：

• 紫外透照
• 蓝光透光照明
• 白光透射光
• 白色反射光
• 可见荧光激发
• 近红外荧光激发

光源数量与其质量之间没有相关性。关键在于所安装的波长和滤光片是否与实验室中已使用的染色剂、抗体和荧光标签兼容。

购买系统前请查看实验室的试剂清单，确保应用支持。请注意，并非所有荧光染料都能被捕获，因为该系统被称为“荧光成像仪”。

化学发光和荧光非常相似

在化学发光西方吸迹中，光是由化学发光反应产生的，通常基于抗体酶和发光底物。信号会随时间变化——成像应在试剂推荐的工作时间范围内开始。

通过荧光进行的西方吸迹需要激发的外部光。它可用于多路复用实验，因此可以通过不同的荧光通道检测同一膜上的多个靶标。

化学发光通常用于敏感且常规的检测。当多路复用或稳定信号捕获或定量比较至关重要时，通常会选择荧光。没有单一的最佳方法，这取决于检测的要求、靶点数量、抗体、所用标签和分析目标。

如果实验室常规进行这两种测试，应确保拟议系统允许测试既可原状进行，也不涉及复杂硬件更改。

拍照时，考虑动态范围和饱和度

有些墨迹可能有一个非常强的带，而有多个较弱的带。如果曝光足够长以显示微弱信号，强波段可能会被饱和。

当光线太强，摄像头的像素无法再捕捉时。此后，显示波段的表面清晰度会被保留，但强度水平将无法用于定量比较。

动态范围是指成像系统能够在单幅图像中记录的弱信号到强信号的范围。更大的动态范围使得录制微弱和强烈的频段更为容易，同时不会丢失任何信息。

一些成像平台可以检测饱和像素，建议合适的曝光或使用多重曝光。它们可以减少试错成像的次数，但并不打算替代良好的实验设计。即使样本过载，检测阶段仍应校正，抗体信号过强也应进行校正。

应避免使用自动曝光

如果有多人轮流使用仪器，或者存在任何可能使信号强度难以测量的因素，自动曝光会非常有用。

有些系统会获得短期初始暴露，然后基于此建议整体暴露。光源、焦点和应用设置由他人自动选择。

这可能使常规影像检查更快，但请务必由操作员确认。检查是否：

• 注意：重要频段标明饱和度。
• 背景上方可见弱带
• 完整样本覆盖了整个视野。
• 为了获得最佳效果，使用了正确的成像模式。
• 使用了必要的滤网和托盘
• 以下是定量分析，需要穿上暴露服：

自动设置是个不错的起点，但绝不是不检查画面的借口。

确保分辨率、灵敏度和视野都正确

分辨率对相机捕捉的图像很重要，但像素数并不代表相机的成像质量。

同时，拥有一个足够灵敏、背景低、光学性能良好、均匀且视野足够大的系统，以容纳实验室中使用的凝胶或膜也非常重要。

如果化学发光信号较弱，则需要非常灵敏的相机。波段间距离越远，所需分辨率越低;带间距离越小，分辨率越重要，样品中要分离的特征越小，所需的分辨率越高。

购买前，将最大的实验室凝胶托盘、印迹或多凝胶托盘放置在成像部位。如果大块凝胶被切成多张图像，则是浪费精力，且比对会更加困难。

确保图像的拍摄保持一致

建议在相同条件下拍摄图像。

写入成像模式、光源类型、滤光片、曝光时间、分组、对焦、样品位置、分析设置，以及背景和任何背景修正。如有必要，重复使用已保存的协议。

如果染色或脱染，确保核酸和蛋白质凝胶的条件一致。控制对照样本的装载、抗体浓度、底物时间以及膜的处理方式。

成像仪只能记录放入样品的部分。它无法解决转移不均、背景过多、通道过载或抗体特异性缺失的问题。

测试分析软件

常用的任务应该不难用图像分析软件完成，软件也不应掩盖结果的生成过程。

一些巧妙的功能可能包括：

• 车道与带检测
• 分子量估计
• 背景减法
• 带强度测量
• 饱和警告
• 归一化
• 多路复用显示
• 图像注释
• 数据导出
• 当用户或实验被记录时。

内置分析功能适合日常工作，桌面软件可能更适合详细分析和最终图表准备。例如，热飞舍成像系统提供机载采集和分析以及外部软件工作流程。

尽可能保留原始图片文件。要调整显示的图像，不应取代原始采集数据。

务必采取预防措施，并采取额外措施确保样本安全

提供适当的屏蔽非常重要，因为紫外成像设备发出的直接或反射紫外线可能对眼睛和皮肤造成损伤。通过封闭成像室可以减少曝光，这比开放的紫外线灯箱更小。

如果要从凝胶中提取DNA，使用蓝光激发法可能更适合染色核酸染色。白光成像消除了使用紫外线来观察可见的蛋白质染色。

系统设计还应确保防止样品间的污染。清洗样品托盘，尽快处理缓冲液溢出，并遵循制造商关于滤镜、镜头和成像表面清洁的指导。

确保系统设置为光学仪器

分子生物学成像仪不能偶尔清洁一次。

光源随着时间会磨损，滤镜可能划伤，样品托盘可能染色，灰尘也可能影响图像质量。实验室应跟踪照明，检查托盘和滤网，备份采集协议，仔细更新软件并维护维护文档。

如果画质不好，就把整个流程都检查一下，看看相机或链条的其他部分是不是有问题。这可能由染色、样品或基材、曝光设置、光源或滤镜引起。

结论

最有用的平台并不总是功能最多的那个。它提供了合适的照明、灵敏度、动态范围、软件、成像区域和工作流程，其他用户都能复制。

它的良好成像从样品准备阶段开始。仪器记录实验过程，但如果检测的准备过程细致且采集过程反复进行，那么图像（记录）是有意义的。

常见问题

问题1。分子生物学成像系统能捕捉什么？

它能够根据不同设置捕获DNA和RNA凝胶、蛋白质凝胶、化学发光西方墨迹、荧光西方墨迹和比色膜。

问题2。凝体记录系统和西部印迹成像仪有什么区别？

不一定。基本凝胶系统可能仅支持紫外、蓝光和白光成像，而西方墨迹成像仪可能需要灵敏的化学发光或多通道荧光检测。

问题3。为什么动态范围重要？为什么动态范围很重要？

宽广的动态范围可以捕捉弱信号和强信号，而不使最强信号被饱和。这在定量分析中尤为明显。

问题4。自动曝光可以信任吗？

确定起始曝光范围会很有帮助。操作员还应观察其他因素，如饱和度、背景、信号弱和成像模式。

问题5。哪种成像模式最好？

所采用的模式取决于样品、染色、标记和分析目标。光源、滤光片和相机设置取决于检测方法。