难以裂解样本中DNA断片优化指南

DNA断片是样本制备中的重要步骤，涵盖基因组学、分子诊断和蛋白质组学等多个学科。然而，强硬的细胞壁或坚硬组织的存在，在实现一致且高质量的DNA断片过程中带来了重大挑战。本指南解决了顽固易裂解的生物和组织相关的难题，提供了一些基于证据的优化建议，并讨论了聚焦超声技术的优势。

[DNA片段化|AAT生物探索]

顽固易裂解样本的挑战

在研究和临床实验室中发现的生物样本涵盖了微生物界和植物界。分枝杆菌和孢子形成菌株，以及富含纤维素和木质素的植物组织的强细胞壁，抵御大多数标准样品制备方法。

是什么让一些样本不愿意进行裂解？

• 与动物细胞相比，革兰氏阳性菌、分枝杆菌、真菌和植物的细胞膜需要更多的机械或化学能量才能被破坏。

裂解不足会带来什么影响？

• 样本破坏不良导致DNA产率低、测序文库偏置，以及PCR的下游效应，如效率低下和定量不良。

对于这类样品类型，标准方法如化学消化、冻融循环和敲珠方法依赖于更受控的机械破坏，因为结果不稳定。

DNA断片理解的进展

关键的科学发现为理解碎片化奠定了基础。在2025年的一项重要研究中，Fu等人发明了一种由锆珠介导的超声剪切方法，仅需20秒超声波处理，即可从纯化的λDNA中获得约15千碱基对的片段。该方法突破了单分子测序（SMS）的边界，解决了利用传统超声剪切技术生产低效≥10 kbp片段的瓶颈。

[一种快速高效的锆珠介导超声策略

DNA断裂率可达10 kbp——RSC Advances]

在2025年发表的另一项重要著作中，哈曼及其来自马克斯·普朗克高分子研究所和亚琛工业大学的同事描述了利用超声波实现DNA序列控制的片段化。这项工作描述了利用切口将先前随机断裂的DNA链中特定且有意的弱点重新定向的过程。该研究发表在《化学》杂志上，为开发实现复杂且具挑战性样本的受控碎片方案提供了新思想和额外维度。

DNA碎片化的挑战与考虑

[约翰内斯·哈曼、鲍里斯·N·舒普、阿曼·伊沙卡特、阿尔朱纳·塞尔瓦库马尔，

罗伯特·格斯特尔、弗劳克·格雷特和安德烈亚斯·赫尔曼。

“DNA的序列特异性、无机智团的机械化学。”化学（2025年）。]

为了实现耐药样本中的DNA碎片化，必须控制和微调多个参数。通过调整以下措施可以改善结果：

• 超声强度和振幅：强度越高，空穴现象越多，破坏效果越好。更高的强度还增加了样品热和机械损伤的风险。

• 处理时间：长时间超声处理可能导致不可接受的过度碎片化。

• 样品体积和浓度：稀释和浓缩样品的输入能量不同。应测量此差异以确定最佳样本体积。

• 缓冲剂组成：使用洗涤剂和螯合剂会协同削弱细胞壁，并因机械破坏而增强，从而提高产率。

• 温度控制：热稳定性的丧失可能导致碎片样品变性并失去结构完整性。如果系统处于等温状态，就可能发生这种情况。

• 珠子数量及其大小：在珠子碎片化中，珠子的大小和数量非常重要。

Saputra 等人（2024）比较了多种DNA提取方法。他们证明超声波处理能产生高质量的DNA。根据他们的数据，61%的超声波DNA吸收率介于1.8到2.0之间，较低波长背景的吸收率较为不明显。相比之下，使用自旋柱法提取DNA时，提取的DNA产率更高。这表明在某些诊断方法中，样品纯度可能比样品浓度更重要。

聚焦超声技术：一种精准的替代方案

基于声波的常见技术存在若干缺点。探针超声器会导致样品污染，需要大量清洗，最终导致样品被无控加热。水浴超声波器分散能量，结果不稳定。

聚焦超声平台，比如 BoFU-800使用完全不同的设计。消除能量损失、在处理困难样品时获得高度可重复的结果和可靠性，这些只是超声波的额外优势之一。

• 非接触式处理：聚焦能量系统在声学介质中对样品进行声波处理。消除样品与探针接触，样品污染的可能性较低。

• 真实低温控制：超声波加工的热量不会影响结果。通过我们改进的温度测量和控制技术，我们可以对样品内的温度做出准确且有针对性的调整。

• 可适应吞吐量：八个采样位置中的每个都可以有独立的自定义用户设置。用户还可以处理从一到八个样本。该系统实现了灵活的吞吐量。

• 批量处理模式：当各位置的样品相同时，可对所有样品位置应用自定义设置。这使得用户可以通过一个命令处理多个采样位置。

• 完全可追溯性：可随时访问每个样品处理信息，实现实验记录的完整可追溯性。

特定样品类型的应用

分枝杆菌

结核分枝杆菌的细胞壁富含菌粒酸，极难穿透。聚焦超声产生机械空化并破坏细胞壁，完成核心裂解步骤约60秒。从群体培养到样本提取物的整个过程不到五分钟。

丝状真菌

丝状真菌的细胞壁含有几丁质和高聚糖。虽然穿透困难，聚焦超声波可将样品准备时间缩短至五分钟，且仅需60秒超声波处理。

植物材料

植物细胞壁的主要成分是木质素和纤维素。对于聚焦超声，其均匀且一致的均质化和碎片化能力对于满足从植物和动物组织DNA提取等多样化需求至关重要。

FFPE样本

对于FFPE组织，甲醛交联在工艺的每个阶段都存在挑战。聚焦超声通过将脱石蜡、裂解和DNA碎片化结合为一个快速高效的步骤，简化了样品准备，最大化样品产率。

最优协议示例

在处理难以裂解的新样本类型时，最有效的方案开发策略如下：

• 以制造商设置为基线：通常，样品类型的特定方案是预先校准的，可以依赖。

• 定义可接受的片段大小：对于NGS，文库构建片段大小通常在300到500 bp之间，而长读序列测序则≥10 kbp。请合理考虑尺寸。

• 时间-周期实验中恒功率剪切持续时间：优化时间窗口的长度。

• 电泳验证：在时间周期研究中，考虑样品制备和片段大小。

• 记录并传达所有必要参数：要精确复制样品制备步骤，必须在相关协议中完整记录。

• 热控：样品温度必须保持在目标温度范围内，以避免热伪影的引入。

未来方向

继2025年这些早期被引用的研究之后，我们将继续看到临床诊断和工程与分子生物学的结合，推动DNA碎片化更先进、更强大的工具的诞生。

Lei等人展示了微型化的高强度聚焦超声设备，能够匹配商业设备的样品碎片化，从而解决传统系统中交叉污染和处理不一致的问题。这是朝着更自动化和集成核酸提取迈出的一步，实验室中的样品制备将变得更加标准化和易于获得。

对于采用聚焦超声技术以优化难以裂解样本碎片化的研究和诊断实验室来说，聚焦超声技术的优势包括精度、易于实施和可重复性。将多种样本类型的验证工作流（如分枝杆菌、丝状真菌、植物组织和FFPE切片）结合于一台设备，提升了实验室效率和数据质量，并加速了科学研究和临床实践的转化。

常见问题解答

问题1。什么是DNA碎片化？它对难以裂解的标本有什么作用？

答：DNA片段化对于制备NGS文库是必要的。碎片化本身就是将DNA分解成更小的碎片。下一代测序采用DNA分析，分析各种难以裂解的标本，如植物和细菌，这些样本对传统裂解有抵抗力。

问题2。聚焦超声能在没有任何化学预处理的情况下穿透分枝杆菌吗？

答：聚焦超声为分枝杆菌的菌壳层提供足够的能量和压力，因此可能减少化学处理，甚至完全消除其作用。

问题3。聚焦超声和植物组织的珠子拍打有什么不同？

答：聚焦超声为非接触式且等温，提供更均匀且剪切的机械处理，比起击珠更能控制和减少组织降解。

问题4。在使用聚焦超声波技术时，DNA片段的典型大小是多少？

答：片段大小可能大于10 kb，超声可用于靶向300-500碱基的片段，而下一代测序的典型大小约为300-500碱基。

问题5。 聚焦超声波对从FFPE中碎裂DNA有效吗？

答：聚焦超声能够在剪切交联DNA的同时，有效实现FFPE脱烷烃和细胞裂解。超声聚焦过程快速，并提高了片段DNA的整体产率。