质粒DNA的水平凝胶电泳：分离超螺旋、缺损和线性形式

DNA电泳是分子生物学中广泛使用的一种方法。需要最高层次分离的应用之一是确定质粒DNA的三种主要拓扑形式，分别是上螺旋、缺口（开放环形）和线性形式。我们将展示新的HE-50水平凝胶系统如何实现质粒分离和质量控制，从而实现更高的分离和可重复性。

[核酸凝胶电泳过程的五个考虑点|Thermo Fisher Scientific - 美国]

质粒拓扑：三种形式

质粒DNA不均匀，是三种拓扑异构体的混合物。在分离的背景下，这些形式在DNA电泳过程中会产生不同的迁移速率。

•超螺旋（SC）形式：超螺旋质粒被认为是琼脂糖凝胶中迁移速度最快的物种。

•切口（开放圆形/OC）形式：具有单股断裂的质粒DNA环状排列被松弛，因此被切断。由于有效尺寸较大，该异构体迁移速度比超螺旋DNA慢。

•线性形式：质粒两条共价链断裂后生成线性DNA。这种质粒DNA呈杆状结构，迁移速度比超螺旋慢，但比被切伤快。

在分析用于制造DNA质粒疫苗的质粒DNA质量时，最高监管机构要求制剂中至少80%的超卷形质粒。

质粒拓扑在研究和生物制药中的重要性

在质粒DNA中，异构体的形式会影响疫苗相关过程中的多个因素：

• 转染至哺乳动物细胞：超螺旋质粒DNA在哺乳动物细胞转染中比松弛和线性形式更有效。

•mRNA疫苗生产：体外转录（IVT）需要线性质粒模板，导致开放环状质粒污染物，影响产量和一致性。

• 基因治疗载体制造：高质量的超螺旋质粒对于腺相关载体（AAV）的生产至关重要。

• 稳定性监测：随着切伤或线性形态的频率增加，储存条件和储存时间会影响质粒稳定性。

质粒DNA分析的最新进展

最近有两项研究强调了质粒DNA高分辨率分离的重要性：

1. ZorE介导质粒切伤（2025年）

发表在《自然通讯》（2025年3月）上的一项研究针对细菌防御系统，并展示了对质粒拓扑结构的控制。佐里亚研究所的研究团队描述了ZorE蛋白将超螺旋pSG483质粒DNA缓慢转化为切线形态的过程。该过程被认为是渐进的，并通过ImageJ定量分析了该转变，进行了密度测量研究。观察指出，超螺旋质粒在37°C下孵育60分钟后，逐渐被ZorE（768 nM）划伤。

[ZorE介导质粒剥离（2025）]

*"通过添加EDTA和SDS停止反应，产物在1× TAE缓冲液、1.4%琼脂糖凝胶中用凝胶电泳分离，并用eb染色后处理。"* — 自然传播，2025年

这一发现对利用凝胶系统进行的DNA片段和蛋白质相互作用研究至关重要。

2. 非B族DNA与DNA修复蛋白（2025年）

2025年1月，美国国立卫生研究院（NIH）发表的一篇PNAS报告证明，将二核苷酸重复序列插入pUC18质粒对错配修复蛋白Mlh1-Pms1的结合具有顺式效应。EMSA测试了超螺旋和线性DNA中25 nM至400 nM浓度下的蛋白质结合情况。非B型DNA破坏蛋白质修复功能，并有助于理解DNA不稳定性。

[非B族DNA与DNA修复蛋白（2025）]

质粒DNA电泳的重要考虑

在质粒DNA的电泳中，电泳分辨率的优化至关重要。

HE-50 水平凝胶系统：首选系统

这 Longlight Technology 的 HE-50 水平凝胶系统采用了有利于质粒DNA电泳的均匀设计。

1. 高质量分离

• 99.95%纯铂电极：分离超螺旋从划痕异构体中分离的关键设计元件。

•灵活凝胶格式：研究人员可选择四种托盘尺寸中的任意一种：60×60毫米、60×120毫米、120×60毫米和120×120毫米。最大尺寸的迁移距离足够长，可以以更高分辨率近距离观察迁移的同构体。

2. 面向用户的设计

•带黑色背景的引导装填托盘：深色背景的荧光尺可在多个样品装载时，精确对齐移液器尖端与孔，以便直接比较。

• 高透明聚碳酸酯罐：高可见度设计内置槽，无需打开槽门中断系统，即可实现染料前沿迁移和电泳过程。

3. 安全与效率

•自动关闭盖：打开盖子时，安全开关会切断电源，消除用户装载样品或取出明胶时的电击风险。

• 低缓冲液消耗：下迁移室采用桥式设计，使用更少缓冲液，同时提供足够的离子环境以实现一致且可靠的DNA电泳。

分析质粒异构体的步骤

为了利用HE-50系统实现质粒DNA的最佳分离：

• 制作琼脂糖凝胶：选择四个尺寸中的任意一个，铸造0.8-1.0%琼脂糖凝胶。用1.×TAE缓冲琼脂糖凝胶分析3-10 kb大小的质粒。

• 样品制备：将质粒DNA样本与加载染料结合。使用200-500 ng的质粒DNA。染料样品：载入染料的比例可以是1：6、1：3或1：1.5。使用移液器将质粒染料样本装入琼脂孔。

• 电泳：尺寸为120 x 120毫米的凝胶应以100伏运行。对于100 x 100毫米的凝胶，使用80伏电压。溴酚蓝允许运行45-60分钟。当染料达到底部的三分之二时，电泳停止。

• 可视化与记录：曝光的透明盖可以在盖还在时对胶片进行UV和成像。当分子尺存在时，会观察到正荧光。

• 量化同工型分布：自动化凝胶记录系统量化带强度。超螺旋DNA的百分比由以下公式决定：[SC强度] / （SC OC线性强度）×100。

无阻碍的工作流程集成

HE-50系统旨在实现与现有实验室工作流程的无缝整合：

•电源集成：所需的4毫米香蕉插头兼容大多数电泳电源（我们推荐恒压）。

•成像系统集成：紫外透明盖兼容标准凝胶记录成像系统，无需将凝胶从储罐转移到成像仪。

•方案采用：该系统兼容所有标准琼脂糖凝胶浓度和电泳缓冲液（TAE、TBE、SB），支持已发表的质粒分析方案。

结论

DNA电泳是评估质粒DNA质量最简单且最常用的方法。研究人员可以利用对超螺旋、缺口和线性异构体迁移的了解，优化分离并解读结果。HE-50水平凝胶系统具备纯铂电极、可选凝胶尺寸、加载导向和控制功能，这些都是常规质粒分析中必需的。正如《自然通讯》（2025）和美国国立卫生研究院（2025）所述，琼脂糖凝胶电泳是分析DNA与蛋白质相互作用以及DNA拓扑结构的基本方法之一。

HE-50水平凝胶系统有潜力实现成像系统的完整集成和模块化;通过这种方式，它为客户提供了更多经济实惠的质粒DNA成像系统选择。如需了解更多信息，请向Longlight Technology发送报价请求。

常见问题

问题1。水平凝胶电泳能否识别超螺旋和切齿质粒DNA？

只要电场均匀，且使用0.8-1.2%琼脂糖凝胶，HE-50系统即可识别超螺旋、缺口和线性DNA质粒。

问题2。在电泳过程中，不同质粒形式的迁移速率有多大？

由于质粒形态结构不同，电泳时它们的迁移速率也各不相同。例如，线性质粒形式比圆形形式迁移得更快。线状形式的DNA迁移速率适中，而切口或开放环形的DNA迁移速度最慢。

问题3。有多少百分比的超螺旋DNA被认为是转染的高质量？

质粒DNA的超螺旋形态且含量超过80%，通常被认为是转染和基因治疗的高质量质粒制剂。

问题4。我可以用TAE缓冲液代替TBE来分离质粒异构体吗？

是的，大多数情况下TAE缓冲液可以用于质粒分析。然而，当差异较小且分离较长时间时，TBE缓冲液最适合分离质粒同构体。

问题5。为什么我的质粒样本在凝胶上显示多个条带？

质粒的超螺旋、切痕和线性形态通常观察到多条带。其他带状物可能是消化不良或DNA和RNA污染降解的结果。