使用高灵敏度荧光仪实现可靠的NGS文库定量

不幸的是，低输入的NGS文库可能看似准备测序，但可用的DNA数量仍不足以进行下一步。浓度不确定可能导致稀释错误或不必要的重测。因此，测序实验室最有帮助的问题是，他们的定量方法是否能在其文库达到的浓度水平下提供可靠的结果。

本文将讨论Longlight的QFluo-1荧光仪。它用于研究人员在准备文库和/或归一化决策前获取核酸浓度值。

确定测量的用途

在评估荧光仪之前，首先确定其下一次用途。结果是否用于判断文库是否需要进一步浓度，还是进行稀释，或将多个文库归一化为统一输入？每个决策中容忍不确定性程度不同。

记录实验室中通常遇到的浓度范围;这应包括接近该范围低限的样本。如果仅证明DNA质量良好且干净，也无法揭示导致购买的复杂文库。选择代表性样本，确定验收标准后再比较结果。

明白 什么 QFluo-1的高灵敏度意味着

荧光测定涉及一种试剂，该试剂被选定能够从靶点（例如双链DNA）发出信号。该信号由荧光仪读取，并使用测定特异性校准报告浓度。仪器灵敏度本身并不决定所有DNA、RNA或蛋白质测定的表现——测定试剂是测量的一部分。

据Longlight介绍，QFluo-1对dsDNA的检测灵敏度为0.01 ng/μL，可检测1至20 μl的样品。其产品规格中还提到，可分两点校准，测量时间不超过每样品三秒。请参考这些数据作为规格，使用实验室将使用的检测法和样品类型。

在对该数值进行解释前，先选择该检测

实验室可以测定单一仪器中dsDNA和RNA及蛋白质的含量，但绝不能将其中任何一种视为可互换的检测。选择合适的分析方法，审查其工作范围、样品制备和标准。

在评估NGS文库时，考虑dsDNA检测是否能为该质量控制步骤的特定问题提供答案。朗莱特的 QF 定量检测试剂盒 用于选择性定量解组（dsDNA）和RNA，并标注为QFluo-1兼容。QFluo-1也被报道为多种荧光测定的“开放系统”，但适用性需逐一测定。

小 采样：准备过程中保护

低输入文库通常含有有限的材料，因此在定量过程中尽量减少样品消耗非常重要。确定检测所需的样品数量，并计算剩余样本量以供进一步处理。QFluo-1的指定样品输入量为1-20微升，这为实验室提供了多种选择;但也必须考虑检测混合物和用于该程序的管子。

对标准品和未知物质，均遵循移液、混合和培养条件的相同顺序。检查管子与仪器的配合度，并遵守检测报告中规定的操作程序。Longlight为QFluo-1提供0.5 mL管式，并且还包括 Q管测定管 ——在常规使用前，务必在计划的检测方法中检查管子和试剂的组合。

检查 低 以真实实验室样本结束

没有任何规格表能告诉你所期望的文库制备是否能为你带来可重复的结果。评估时，应根据检测说明使用标准品，然后使用涵盖实验室样品范围的样品。

将多个或多个会改变工作流决策的药物，加到该浓度的最低范围内。

测量重复，非重复，读取仅用一根管。这一区分反映了移液或试剂制备造成的差异。注意任何超出检测范围的样品;预先确定是否稀释、重跑或报告为<验证。

度量 速度 在整个工作流程中

快速的仪器读取不需要几秒钟的检测。应设置标准品和样品，且可能需要培养所用试剂。设计整个过程的通量，尤其是在大量文库同时进来时。

根据Longlight的说法，QFluo-1的读数时间每个样品不超过3秒。为样品试验计时、校准、读数和结果记录。这能让您对仪器在实验室质量控制计划中的契合度有清晰的了解。

这 结果 被转换为图书馆质量控制规则。

基于荧光的定量提供DNA浓度信息，但无法评估文库片段大小分布，也无法区分完整测序文库与其他DNA物种。根据文库制备方法和测序平台，可能需要额外的质量控制方法，如片段分析或基于qPCR的文库定量。

添加一份文档以记录已批准的QFluo-1方法。

QFluo-1配置成功后，注意QFluo-1配置、所选测定、管材类型、标准制备和标准验收标准。添加样品体积并报告结果。这将成功的演示转化为多种操作员都能以相同方式使用的工具。

如需申请报价或试验，请向Longlight提交分析物、预期浓度范围、每日样品数量及预期检测方法。通过其 联系页面.

结论

在NGS实验室中，使用灵敏度荧光仪的重要性在于他们在低浓度下能做出的决策。使用适当的检测方法、代表性文库和可重复的样品制备来评估QFluo-1。每一个浓度结果在质量控制规则中记录后，都更容易被处理。

常见问题解答

问1。在NGS图书馆工作流程中，QFluo-1测量了什么？

它用于通过适当的荧光测定测量目标分析物（如dsDNA）的浓度。选择该材料的检测方法和质量控制决定。

问题2。上述灵敏度是否足以批准某种方法？

否。在决策极限附近评估测试代表样本，并在常规使用前评估重新制备的样本。

问3。三秒的读数是否意味着整个检测过程需要三秒？

不。样本和标准制备，任何必要的孵育和结果记录都很耗时。

问题4。为什么测试重复制剂比反复读取管子更重要？

不同的制剂显示出移液和/或检测设置过程中产生的制备差异。所有这些处理差异无法通过对同一管的重复读数来区分。

问5。高灵敏度荧光度计是否免除了校准的需求？
不。遵循检测的校准和质量控制要求，保持测量的可靠性。