用于100千道化以内目标的高分辨率低温电磁：新方法与实际成果

高分辨率冷冻电子显微镜已成为结构生物学中的常规方法，但近75%的人类蛋白质编码基因产生的蛋白质量低于50 kDa——这一部分在电子显微镜数据库（EMDB）中仍然严重不足。这一差距并非因为重要性不足，而是由于一个根本的物理限制：较小的粒子相对于背景噪声产生更弱的信号，使得在图像处理过程中难以捕捉和对齐。

共价约束的“二宝石体”使平行结构解成为可能

由cryo-EM制作 |自然化学生物学

在过去几年里，我们有幸见证了大量实用应用和创新的涌现，包括工程化支架、AI优化的刚性工具、先进工具以及更高效高效的工作流程。在这里，我们将讨论目标降压低于100千达的挑战、应对这些挑战的最新方法，以及这些方法如何开始成为标准实践的一部分。

小蛋白的挑战

单粒子低温电磁效果最佳，适用于大型复合物。信号充足，使三维模型的对齐和重建过程更加容易。然而，对于较小的目标，存在两个持续的挑战：

• 降低信噪比：较小的配合物散射电子更少。因此，这些目标在区分真实信号与背景噪声变得更加困难。

• 结构成分不足：小蛋白缺乏显著特征。因此，低温电磁算法在粒子选择和方向方面存在困难，导致高B因子和质量较差的重建。

这些挑战解释了EMDB中沉积结构中不到4%低于100 kDa，尽管真核生物和原核生物中小蛋白都丰富。

使冷冻电磁能针对小蛋白靶点的技术

为解决低信噪比瓶颈，已经探索了多种不同的方法。大多数方法都涉及保持小靶蛋白的天然构象。主要方法是增加目标蛋白和复合物的有效尺寸。

质量增强支架：简单明了

结合蛋白质和基于蛋白质的支架有助于增加颗粒质量，从而改善排列。三款成功的杰出脚手架设计包括以下几款：

• 二宝石体（《自然化学生物学》，2025）：结合受限共价纳米体二聚体和工程界面捕获，使几乎所有支架蛋白质结构测定成为可能，包括最近解析出14 kDa的鸡卵清溶菌酶冷电显微结构，这是迄今为止最小的冷冻电子显微结构。牛津大学罗莎琳·富兰克林研究所和钻石光源公司开发了这种模块化方法，无需传统上耗时的重新优化步骤来寻找新的蛋白质靶点。

共价约束的“二宝石体”使平行结构解成为可能

由cryo-EM制作 |自然化学生物学

• DARPin-Apoferritin 支架（IUCrJ， 2025）：对称、八面体和1兆道尔吨apoferritin设计支架蛋白，使得样品拥挤和低温EM近原子和亚原子分辨率实现（实现蛋白质刚性和排列改善70%）。

IUCr）一个大型、通用且模块化的DARPin–apoferritin支架

通过低温电子显微镜技术实现小蛋白的可视化

• 二硫键刚性Fabconstr（自然通讯，2025）：通过迭代分子工程，该设计实现了2.3–2.5 Å的分辨率，并提供了高分辨率的低温电磁结构。

二硫化物约束的Fabs克服了目标尺寸限制

高分辨率单粒子低温电磁 |自然传播

高级仪器与数据处理

并非所有实验室都需要脚手架。对于大多数行为良好的低分子量膜蛋白（小于100 kDa），由于仪器和数据处理方法的进步，分子结构的确定是常规的。

• 更高放大的瞄准，冰薄如冰。针对薄冰区的放大倍率可以提升采样量，降低数据噪声。

• 利用二维模板匹配改进对齐。低kDa（低于50 kDa）复形的比对通过二维模板匹配和结构良好解析作为先验得到改进。单粒子低温电磁的最低kDa限制估计约为38 kDa。

• 伏打相位板用于提升对比度。增强低空间频率相位差的相位板可以促进观测小于衍射极限尺寸的粒子。表面链亲亲胺四聚体（52 kDa）被解析为3.2 Å（伏打）相板，因此体现了小样品相板的价值。

Longlight Technology 如何支持低于 100 kDa 的低温电子显微电磁项目

在Longlight Technology，我们深知这一点 低温电磁 是一种工具，而非终点——尤其是对于样本有限且结构路径极少线性的小蛋白靶点。我们的服务围绕三个原则构建，这些原则符合研究人员解决具有挑战性低质量目标的需求：

• 透明、分阶段的工作流程：每个项目都从样品适宜性评估开始，通过负染色检测以验证均匀性、聚集状态和颗粒形态，然后才投入高分辨率数据收集。这不仅节省了时间，也节省了宝贵的资源。

• 高端仪器的访问：在我们的设施中，我们支持使用Glacios 2（一款200 kV的高效低温电磁系统，优化用于常规单颗粒分析）和Titan Krios G4（一款300 kV旗舰平台，旨在释放最大稳定性和分辨率）的低温电磁场和低温电磁器应用。在初步筛查和评估中，我们还提供Talos L120C G2，为团队提供评估样本行为的机会，无需过度投入资源。

• 完全数据透明：我们提供所有原始冷冻电子显磁胶片、处理后和未处理文件的所有文件、最终的3D密度图及相应分辨率、所有原子坐标模型（如有）以及所有交叉验证报告。完整的数据可用性确保你的解读不受服务提供商选择分享的内容限制。

Longlight Technology 成立于2015年，专注于分子诊断和结构生物学，不仅提供低温电子显微镜服务，还提供精密实验室仪器和基因组消耗品，如聚焦超声波系统和核酸提取套件。我们的制造专业能力使我们能够从样品准备到最终结构输送支持研究人员——这一集成方法对于对样品处理精度至关重要的小蛋白项目尤为重要。

结论

针对100千道尔以下目标的高分辨率低温电磁从前沿挑战转变为可解决的问题。无论是通过质量增强支架、二硫约束片段抗体、AI设计的刚性系统，还是现代仪器上的优化数据收集，现有工具已能解决历史上将小蛋白排除在冷冻电子显微镜革命之外的低信噪比障碍。随着全球冷冻电子显微镜市场的扩大以及像Longlight Technology这样的服务提供商让这些工具更加普及，结构生物学终于开始认识到小蛋白并非外围的存在——它们是多数。

常见问题解答

问1：目前高分辨率低温电磁的最小尺寸限制是多少？

通过优化支架（如双宝石体、修剪体），数据采集有效范围可达~14-20千道尔。现代300 kV仪器可解析50-70 kDa的蛋白质，无需支架。

问2：所有低于100 kDa的构造都需要支架吗？

不。高质量的可溶性蛋白质>50 kDa，可以在没有支架的情况下被解析。信噪比差或50 kDa<蛋白质时，支架最为有用。

问3：低于100千道达的低温电显需要多少样品？

负染色时：~100微升，压力~1克/升。对于高分辨率单颗粒分析，起始时需要相同范围的样品量，但网格优化可能需要额外材料。采样消费是Longlight Technology的工作流程中的一部分。

问4：对于一个50千道化平板但没有支架的靶材，预期分辨率是多少？

仪器选择会影响数据收集。例如，对于Titan Krios G4或Glacios 2，分辨率可以从3.0 Å到4.5 Å不等。无支架的50千道尔顿以下范围具有挑战性，因此质量增强是首选方案。

问题5：我可以拥有Longlight Technology设计的脚手架吗？

我们专注于数据收集、评估以及透明的数据处理。特别是在支架工程（如纳米体或DARPIN）方面，我们要么支持客户的报价，要么与优秀合作伙伴合作。

参考文献：

Yi， G.， Mamalis， D.， Ye， M. 等人。共价约束的“二宝石体”通过低温电显技术实现平行结构解。《自然化学生物学》22,69–76（2026年）。

Kung， J. E.， Johnson， M. C.， Tegunov， D. 等。二硫化物约束的 Fabs 克服了高分辨率单粒子低温电磁的靶标尺寸限制。Nat Commun 16（2025年）。

配备刚性AI设计支架的Trimbody实现了小蛋白的原子分辨率低温电子显微结构测定。国家公社（2026年）。

一个大型、通用且模块化的DARPin-apoferritin支架，使得通过低温显微显效应（cryo-em）实现小蛋白的可视化。IUCrJ（2025年）。