交联质谱法：常见问题解答与已验证解决方案

交联质谱法已迅速从一项专业技术成熟为结构蛋白质组学和相互作用组图谱的基石。早期创新者如Ruedi Aebersold、Juri Rappsilber、Andrea Sinz及其合作者展示了XL-MS如何验证冷冻电磁模型，解析大型大分子机器的组织结构，并揭示极少能经得起纯化的短暂蛋白接触。基于这一势头，我们集成的服务、仪器和耗材生态系统为交联质谱提供了可重复且高通量的工作流程——从样品规划到数据解读——旨在满足现代发现的需求。交联质谱法（XL-MS）已发展成为结构蛋白质组学和相互作用组分析的核心工具。通过捕捉残基之间的空间限制，XL-MS补充了低温电子显微镜和晶体学，揭示了常被纯化方法无法通过的瞬态蛋白-蛋白质相互作用。

（用于蛋白质构象研究的交联质谱法

以及《蛋白质-蛋白质相互作用——适用于四季的方法》）

交联质谱仪实际捕捉的内容

交联质谱法（也称为化学交联与质谱结合，CL-MS或XL-MS）利用双功能试剂共价连接位于特定空间窗口内的氨基酸。交联后，靶向酶促消化产生线性肽和交联肽的混合物。质谱随后检测并鉴定这些交联物种，将其转化为距离约束、相互作用伙伴和场地特定信息，供结构模型参考。由于XL-MS提供了蛋白质组学衍生的约束，它通过基础化模糊密度和精炼界面，补充了冷冻电子显微镜和X射线晶体学。

除了其整合能力外，交联质谱法还具有实用优势：可扩展至高通量，支持细胞内应用，且无需基因融合标签或特殊化学标记。关键是，共价交联能够“冻结”弱或瞬态接触，使XL-MS成为亲和纯化或原生MS的有力伙伴，目的是揭示本应消散的相互作用。

为什么采用滞后：持续存在的痛点

即使有明显的好处，仍有若干障碍阻碍常规部署：

-浓缩和可检测性。交联肽通常相较于线性肽较为罕见。如果没有深思熟虑的丰富或分割，识别率会下降，可链接网站的覆盖也会变得零散。

——复杂的评分和验证。复合前体质量和复杂的碎片图案使谱解释变得复杂。对交联对进行假发现率（FDR）控制需要站点感知评分和精心调校的阈值，否则假链可能会漏网。

——化学优化。交联剂的选择和剂量很重要。过联会扰乱原生架构;下联交联会产生稀疏的映射。细胞内交联增加了基质复杂性，从而降低肽回收率。

——仪器方法设计。灵敏度必须与碎片质量进行平衡。如果只使用HCD，片段覆盖可能会不均匀;ETD/EThcD需要校准，以确保多种不同肽对的有用离子能够被回收。

——软件和标准碎片化。异构工具和报告格式使得跨项目比较结果或将XL-MS输出与结构数据库合并进行集成建模变得困难。

交联质谱的实用常见问题解答与经过验证的解决方案

• 我该如何选择十字架–我的系统用链接器？

•将间隔器长度与预期的相互作用距离匹配，并选择与显性残基比对的反应基团（赖氨酸靶向化学物质常见）。

• 试点滴定，控制交联剂浓度和反应持续时间，以防止交联过联。

•在复杂基质中，选择反应性明确且淬火方案经过验证的化学。

• 我怎样才能提高交叉的恢复–关联肽？

• 采用顺序消化流程（例如先Lys-C再用胰蛋白酶），扩大肽段边界并减少遗漏切割。

• 结合肽级富集与正交分馏，先于LC-MS聚焦交联物种。

• 哪个LC–MS设置会提高识别率吗？ （没有单一的LC-MS方法能适用于所有交联肽。方法优化应被视为XL-MS工作流程的一部分，而非一次性的设置。）

• 获取高分辨率的MS/MS并调节碰撞能量，以平衡主链和交联剂碎片化。

• 考虑混合断片（HCD辅以ETD或EThcD），以获得更丰富的交联对序列覆盖。

• 我如何控制错误的发现？

• 针对交叉链接搜索量身定制的目标诱饵方法，并强制执行delta分数、站点级和链接类型过滤器。

• 验证生物和技术复制间的关键关联，并与冷冻电磁密度或正交生化检测进行交叉核对。

• 交联质谱能捕捉活细胞中的瞬态相互作用吗？

• 是的——细胞内的交联可以保留短暂的相互作用。优化淬火和裂解以保证加合物完整性，并在MS发生前利用浓缩管理基质效应。

• 我该如何整合XL–多发性硬化症（MS）冷冻治疗–EM或X–雷？

• 提供链环特异的距离界限和置信度量。使用 XL-MS 约束来定位域、确认接口，并标记不一致区域以便模型细化。

（胺反应性NHS酯类反应，BS3（上面板）为例。

与蛋白质的反应产物包括肽内交联（1型;左侧），

肽交联酶（2型;中间），

以及“死胡同”交联“或”单链“（0型;对））

一个加速XL的集成服务和产品堆栈–手稿

我们提供 端到端XL-MS服务涵盖实验设计、化学优化、样品制备、液相-质谱采集和数据解读。这种综合方法最大限度地减少了试错，减少了错误发现，缩短了从试点实验到可发表成果的路径。客户可以提交预先交叉链接的样本，或从一开始就与我们团队共同设计工作流程。

• 为什么我们的基因组学解决方案和实验室设备能增强XL–手稿?

XL-MS受益于稳定的上游样品制备和稳健的下游检测。我们提供先进的仪器、高品质试剂和耗材，支持交联质谱及相关组学流程，应用于学术、临床和工业环境。以高效和准确为驱动，我们的工作流程支持高通量研究，数据质量一致——这是自信解读交联肽谱的理想条件。

• ChIP-Seq与染色质相互作用分析

当项目结合交联质谱分析蛋白-染色质接触时，ChIP-seq增加了位点特异性的基因组背景。通过全基因组绘制转录因子和组蛋白结合位点，ChIP-seq有助于将XL-MS抑制与功能调控景观连接起来，强化机制结论并为后续实验提供指导假设。

• 基因组学与样本制备支持

Longlight专注于分子生物学和分子诊断，拥有一系列与国家神经系统相关的仪器和试剂，包括用于精确文库制备的聚焦超声波解决方案。这些能力稳定了上游样本质量——这是常被忽视的成功决定因素——使交联质谱能在批次和项目间产生可解释、可重复的结果。

• 减少变异性的消耗品和套件

我们供应预制琼脂糖凝胶、核酸清除剂、量子比特管、核酸提取套件和图书馆制备套件。使用通用消耗品和严格的标准作程序减少日常变异性，帮助团队在重复测量和多组学集成中稳定地实现XL-MS性能。

• 简化建议以防止常见错误

• 运行试点滴定，调整每个基质的试剂浓度和反应时间。

• 采用标准化蛋白酶工作流程和肽级浓缩以提高交联肽产量。

•记录LC-MS方法版本，并在适当情况下支持高分辨率混合HCD/ETD或EThcD碎片化。

•设置严格评分、差异评分和站点级过滤器，并在独立的技术和生物复制中重现优先链接。

• 将交联质谱法与冷冻电磁或X射线结合，揭示连接剂特异的距离界限和置信度指标，用于整合建模。

从试点到规模化：你的下一步

规划用于蛋白质相互作用图谱绘制、结构验证或整合建模的交联质谱？与我们的专家合作，设计一个可靠、高通量的工作流程，优化以满足您的目标。我们将就交联剂选择提供建议，组织样本提交，并进行消化、富集、多发质采集和数据分析。请期待一份简明扼要的报告，并附带可作的见解。与我们合作，降低风险，解决常见瓶颈，并将XL-MS从早期试点提升为可靠的日常发现。